Джеймс Уэсли Марстерс назван в честь отца и проповедника Джона Уэсли.
Его отец священник, мать работала социальным работником. У Джеймса есть брат Пол и сестра Сьюзен. Вскоре после рождения Джеймса семья переехала в город Модесто. После развода родителей дети остались жить с мамой.
У Джеймса кудрявые каштановые волосы (очень кудрявые, осветлитель, которым он пользовался для съемок в Баффи, очень выпрямил волосы). У Джеймса голубые глаза и невероятно красивые скулы.
У Джеймса есть некоторые особые приметы, включая знаменитый шрам на левой брови (полученный в Нью Йорке) и на левой ноге (полученный из-за несчастного случая в 5 классе, Джеймс пропорол ногу опрыскивателем газона. Травма оказалась тяжелой, и целый год Джеймс не ходил в школу).
В четвертом классе Джеймс дебютировал в школьном спектакле « Винни-Пух» в роли ИА-ИА.
В девять лет Джеймс увлекся игрой на гитаре. В 13 лет он открыл для себя панк-рок. Он одевался, причесывался и вел себя так, что все от него шарахались. Но все это не помешало ему продолжать актерскую карьеру: он играл в местном любительском театре. По его признанию, он впервые поцеловался именно на сцене в 14 лет… причем с девушкой старше него.
Окончив школу, Джеймс уехал из Модесто в Санта-Марию, штат Калифорния, чтобы поступить в Тихоокеанскую консерваторию Сценического Искусства (the Pacific Conservatory of the Performing Arts (PCPA)). Он проучился там 2 года с 1980 по 1982, и сейчас говорит, что там он получил лучшие уроки актерского мастерства. Вечерами он подрабатывал официантом и менеджером в ресторане под названием Omlets & More.
Закончив консерваторию, Джеймс переехал в Нью-Йорк и поступил в престижную Джулиардскую школу, куда на актерское отделение ежегодно принимают всего лишь 20 человек для строгого трехлетнего обучения. Выпускниками этой школы были Вэл Килмер и Кевин Спейси. Джеймс много работал на различных тяжелых работах, чтобы оплачивать обучение. Но, к сожалению, Джеймсу пришлось покинуть Джулиардскую школу после двух лет учебы (с 1982 по 1984) из-за разногласий с преподавателями.
Живя в Нью-Йорке, Джеймс долгое время работал барменом. Жил в съемной квартире в одном из самых бедных районов – в квартале Куинси. Где, кстати, на него напали, когда он возвращался домой с работы. Результатом этой стычки стал шрам на левой брови. В Нью-Йорке Джеймс приобрел своего любимого кота Захари (Zachary). Кот оставался с Джеймсом пока не умер в 2000 году.
В 1987 году Джеймс переехал в Чикаго. Его профессиональный дебют состоялся на сцене престижного театра Goodman Theatre в спектакле по пьесе Шекспира «Буря». Джеймс играл идеального человека Фердинанда. Постановка была авангардной. Привязанного к гигантскому колесу, Фердинанда выкатывали на сцену … обнаженным. А перед каждым выходом рабочие показывали ему порнокартинки, чтобы возбудить.
Еще несколько лет Джеймс оставался в Чикаго, и работал в хорошо известных театральных труппах, таких как Northlight и Bailiwick, а также создал собственную труппу Genesis Theatre Company, где ставились новые, экспериментальные, «опасные пьесы». Но прием чикагской публики не всегда был теплым, и в 1990 году Джеймс с двумя друзьями перебрался в Сиэтл. Там они надеялись найти больше понимания со стороны зрителей.
В Сиэтле они создали труппу New Mercury Theatre (в честь труппы Орсона Уеллса) и некоторое время выступали в подвалах церквей и ресторанов. Среди их постановок «Жизнь как сон» Педро Кальдерона де Ла Барки (известная, как «испано-язычный Гамлет»), «Антигона» Ануя, Шоу «Мезальянс». ««Мы привлекаем зрителей, которые хотят, чтобы их удивляли, бросали им вызов» - говорил Джеймс. Он сам ставил спектакли, сам же в них и играл, одновременно с этим он был еще и осветителем и бутафором. И, как говорили, он был особенно хорош в образах «испорченных, неуравновешенных персонажей» (напоминает черты Спайка?).
В начале 90-х Джеймс получил несколько случайных ролей в телесериалах: Northern Exposure и Medicine Ball. В промежутке между ролями он продолжал работать на низкооплачиваемых работах, чтобы заработать на жизнь. Время от времени он подрабатывал телемаркетингом в компании Philip Morris, но чаще работал барменом или официантом.
В октябре 1996 Джеймс переехал в Голливуд. Свой переезд он сформулировал следующим образом: «Я хотел продаться - весело и без комплексов!»
Чтобы обрести успех в Голливуде, Джеймс сбросил 22 кг. А еще раньше ему пришлось похудеть с 68 до 61 кг для роли в Шоу «Мезальянс», где актриса должна была нести его на сцене.
Джеймса пригласили на прослушивание в сериал Джоса Ведона «Баффи - Истребительница вампиров». Его решили взять на роль блондинистого вампира Спайка. Сначала планировалось, что персонаж Джеймса умрет в конце 10 серии 2 сезона What’s My Line part 2, но Спайк так понравился и зрителям и сценаристам, что его решили оставить до конца сезона. В 3 сезоне его вернули на один эпизод – 8 серия Lover Walk, а с четвертого сезона Джеймс вошел в основной актерский состав.
После 7 заключительного сезона «Баффи» персонажа Джеймса перенесли в сериал спин-офф «Ангел».
Джеймс стал соавтором комиксов из серии «Баффи – Истребительница вампиров» «Спайк и Дрю» (совместно с Кристофером Голденом). Но, как известно, он был разочарован иллюстрациями и больше не принимал участия в работе над комиксами.
В 2002 Джеймс создал рок группу Ghost of the Robot. Сначала они выступали в маленких клубах Лос-Анджелеса, но по мере того, как росла популярность Джеймса группу стали приглашать на более престижные площадки. И уже летом 2002 они выступили в Париже. В феврале 2003 они выпустили свой первый альбом «Mad Brilliant”. Летом 2003 группа Ghost of the Robot совершила свое первое европейское турне, в 2004 – второе, после чего группа распалась. С тех пор Джеймс выступает соло. В 2005 он выпустил альбом Civilized Man, а в 2007 – Like a Waterfall/
В марте 2005 на телеэкраны вышел фильм «Охота за бриллиантами, в котором он играет реальную личность – обоятельногомошенника Бобби Комфорта, сумевшего провернуть самую большую кражу драгоценностей в истории США. А с сентября 2005 Джеймс начал сниматься в сериале «Смолвилль», где он играет криптонца Брэйниака (профессор Милтон Файн).